脊髓空洞前状态；细胞凋亡；Bcl2；Bax
脊髓空洞前状态（presyrinx state）是脊髓空洞形成的初始变化〔1〕。国内张庆俊等称其为空洞形成前期，组织学上存在着明显的缺血、水肿性改变，MRI 表现为上颈髓T1WI呈略低信号、T2WI呈高信号且不能为FLAIR所抑制〔1，2〕。近年来，有证据表明在神经系统发育和急慢性损伤中可见到凋亡发生〔3〕，但脊髓空洞前状态中是否存在细胞凋亡以及与Bcl2和 Bax的关系未见报道。为此，本研究检测脊髓空洞前状态中神经细胞凋亡情况以及与Bcl2，Bax表达变化的关系，为探索脊髓空洞症的有效治疗手段开辟一条新的途径。
1 材料与方法
11 材料
56只健康、8～10周龄、体重15～20 kg的新西兰白兔(河北医科大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，随机分为3组，其中Kaolin(高龄土、白陶土)组40只，生理盐水组和假手术组各8只。一抗为鼠抗Bcl2 mAb、鼠抗Bax mAb(Santa Cruz公司)。SABC免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司产品)。
12 方法
121 动物模型制作
在氯胺酮（30 mg/kg）静脉麻醉下，动物取俯卧颌低位，颈后部备皮消毒。按文献〔4〕方法，用412号针头行经皮枕大池穿刺术，缓慢抽取无色透明脑脊液06 ml，Kaolin组动物缓慢注入37 ℃、25％Kaolin悬浊液06 ml；生理盐水组动物仅注入37 ℃生理盐水06 ml；假手术对照组只行枕大池假穿刺。模型成功标志：枕大池穿刺抽出无色、透明脑脊液，Kaolin顺利注入枕大池且动物出现一过性四肢瘫。麻醉清醒后2 h，动物分笼饲养，应用抗生素预防感染，必要时予以营养支持。
122 术后神经功能判定
术后每日，按改良Tarlov评分法对动物进行行为学检查：0分：无自主活动；1分：仅限于髋膝关节的非反射性运动；2分：髋膝踝3个主要关节的活动；3分：能主动支持体重和不协调步态，或偶尔出现协调步态；4分：前后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动；5分：正常步态。
123 标本的制作和采集
术后第1，3，7，14，21天，kaolin组动物各随机选取8只、生理盐水组和假手术组各1只，在氯胺酮过度麻醉下，40 g/L多聚甲醛经心脏灌注，经后正中切口、咬除脊突和椎弓根，取出上颈髓置入相同固定液中后固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋、4 μm切片并裱于经10 g/L多聚赖氨酸处理的清洁载玻片，用于HE染色和免疫组织化学染色、凋亡变化观察。
124 Bcl2、Bax免疫组化染色
Bcl2和 Bax的表达按免疫组织化学常规步骤进行。细胞内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒分布者为阳性反应细胞。
125 TUNEL法检测细胞凋亡
按试剂盒说明书操作。阳性判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。细胞凋亡和Bcl2，Bax表达的统计学分析采用HPIAS1000彩色病理图文分析系统，每张切片任取5个视野，高倍镜下记数总细胞数和阳性细胞数，计算阳性细胞的百分比。
13 统计学处理
数据以x±s表示，采用SPSS100 专用统计程序进行单因素方差分析。
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